~比柏創意設計研究所~

大蒜素對大鼠肝損傷細胞因數保護作用

研究大蒜素對高脂飲食致大鼠慢性肝損傷的保護作用及內毒素(Lps)刺激引起肝臟枯否細胞(KCs)分泌細胞因數的變化。方法 Wistar大鼠隨機分為3組，10周後腹主動脈采血測定血漿丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、白細胞介素(IL)拟6、IL拟(10)、腫瘤壞死因數(TNF)拟α水準，取肝組織用於組織病理切片的製備。分離培養KCs，檢測在Lps刺激下KCs上清液中IL拟6、IL拟10、TNF拟α的水準。結果 大鼠發生慢性肝損傷時，血清ALT及IL拟6、TNF拟α水準明顯升高(P<0杄05)，IL拟10水準顯著下降(P<0杄01)，大蒜素可減輕慢性肝損傷，降低血清IL拟6水準(P<0杄05)。各組大鼠分離培養KCs在加入Lps刺激後，上清液中IL拟6、TNF拟α水準變化與以上結果十分相似，藥物組L拟10水準顯著升高(P<0杄05)。結論 大蒜素對肝臟的保護作用，可能通過調節KCs對細胞因數的分泌來實現。大蒜素作為一種來源廣泛的含硫化合物，其對四氯化碳、酒精等引起的肝損傷有明顯保護作用。研究發現，大蒜素對高脂飲食引起的慢性肝損傷有明顯的保護作用，但機制尚未闡明。為此，我們通過複製大鼠慢性肝損傷模型，觀察大蒜素對肝臟枯否細胞(KCs) 分泌調節的影響。

　　1 材料與方法

　　1杄1 材料

　　1杄1杄1 實驗動物 Wistar 雌性大鼠，體重150∼ 170g(山西醫科大學動物中心)。

　　1杄1杄2 主要試劑及藥物 膽固醇(北京化學試公司)；大蒜素膠囊(湖北金龍藥業公司)；IV型膠原酶、胎牛血清培養液(DMEM)、Percoll液、內毒素(Lipopolysaccharide,Lps from Escherichia coli 0111:B4)(美國Sigma公司)；白細胞介素(IL)拟6、IL拟10、腫瘤壞死因數(TNF)拟α(解放軍總醫院科技開發中心放射免疫所)；胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)。

　　1杄2 方法

　　1杄2杄1 動物模型的建立 選用雌性Wistar大鼠36只，正常餵養1周後隨機分為3組，對照組正常飲食飼養；模型組給予高脂飲食(普通飼料 5%的膽固醇 15%的玉米油)；藥物組高脂飲食同時隔日大蒜素(0杄5%， 10ml/kg)灌胃。10周後各組取實驗動物8只，1%戊巴比妥鈉麻醉後腹主動脈采血處死動物，取肝左葉置於10%中性福馬林固定備做病理切片。

　　1杄2杄2 血清指標的檢測 採集的血液經肝素抗凝後，3 000r/min離心15 min，分離血漿，用於丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、IL拟6、IL拟10、TNF拟α水準的檢測，按試劑盒說明書進行操作。

　　1杄2杄3 枯否細胞的分離、培養及鑒定 採用改進Seglen膠原酶兩步灌流和Percoll密度梯度離心法分離得到各組大鼠肝臟細胞，經5%CO2、 37℃恒溫培養箱孵育4h,洗去未貼壁細胞。經台盼藍非特導性酯酶染色，活性和純度分別達到95%時，調細胞數為5×106，接種于48孔培養板中，每組8孔。

　　1杄2杄4 培養上清液細胞因數的檢測 于培養液中加入 100mg/ml Lps2滴，4h後收集培養上清，用於IL拟8、TNF拟α、IL拟10的測定。

　　1杄3 統計分析 計量資料用±s表示，採用SPSS 12杄0軟體進行方差分析(SNK法)。

　　2 結果

　　2杄1 慢性肝損傷結果

　　2杄1杄1 肝組織病理學變化 肝組織病理學顯示，模型組與藥物組大鼠體肝組織均出現不同程度的彌漫性改變，肝內可見到大量的脂肪空泡(肝小葉內含脂滴細胞/總細胞數>1/3)及肝細胞氣球樣變、小葉內和匯管區有大量的以單核細胞、淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤，但未見明顯肝纖維化，表明慢性損傷大鼠發生脂肪肝炎；與模型組相比，藥物組大鼠肝組織炎性細胞浸潤明顯減輕。

　　2杄1杄2 血清ALT的變化 對照組為(61杄5±12杄6)u/L，而模型組與藥物組ALT水準明顯升高，分別為(210杄3±105杄4)，(144杄1±72杄9)u/L，與對照組比較，P<0杄05。藥物組與模型組比較，ALT水準顯著下降，差異有統計學意義，P<0杄05。

　　2杄1杄3 血清IL拟6、IL拟10、TNF拟α的變化(表1) 隨著動物發生慢性肝損傷，模型組與藥物組IL拟6、TNF拟α水準明顯升高 ，IL拟10則明顯下降；藥物組IL拟6水準明顯低於模型組，而TNF拟α降低及IL拟10升高，差異無統計學意義。

　　表1 大蒜素對血漿胞因數的影響（略）

　　注：與對照組比較,a P<0杄01；b P<0杄05；與模型組比較,c P<0杄05

　　2杄2 枯否細胞的分離、培養結果

　　2杄2杄1 KCs形態的改變與對照比較 分離KCs結果表明，對照組KCs體積較小，形態相對規整，胞漿突起纖細，胞漿內僅有少量空泡。而模型組KCs體積明顯增大，核漿比例增大，胞漿突起明顯增多、變粗、胞漿高度空泡化，吳典型的活化狀態。

　　2杄2杄2 KCs分泌細胞因數的變化(表2) 加入Lps後，模型組與藥物組培養上清液中IL拟6、TNF拟α水準明顯高於對照組，IL拟10、水準發生明顯下降。藥物組與高脂組比較IL拟6、TNF拟α水準顯降低，而IL拟10水準顯著升高。

　　表2 大蒜素對大鼠KCs培養上清液細胞因數的影響（略）

　　注：與對照組比較，a P<0杄01，b P<0杄05；與模型組比較，c P<0杄01，d P<0杄05

　　3 討論　近年來，非酒精性脂肪肝炎發病率明顯增高，儘管該病的發生機制尚未完全闡明，但對先天肥胖性ob/ob小鼠和fa/fa大鼠研究表明，KCs分泌功能紊亂參與了疾病的發生。其自然發展成為脂肪肝，特徵有胰島素抵抗、肥胖、脂質代謝紊亂，與人類的非酒精性脂肪肝炎直接相關〔１〕。Yang等〔２〕提出肥胖個體枯否細胞功能紊亂可以增加肝細胞對內毒素的敏感性，從而加速脂肪肝炎的形成。對肥胖、瘦素受體功能紊亂的大鼠、小鼠枯否細胞體外培養發現，枯否細胞表型異常，在給予內毒素刺激後與對照比較，促炎因數IL拟6、TNF拟α表達增加，而抑炎因數IL拟10表達抑制〔３〕。儘管肝臟各種細胞均可產生TNF拟α，但普遍認為內毒素活化枯否細胞是TNF拟α產生的主要來源。研究表明，TNF拟α在脂肪肝炎的發生、發展中起了重要作用，其不僅可通過活化受體，產生各種適應性蛋白、促進肝細胞的抗凋亡〔４〕，也可引發肝細胞線粒體釋放出活性氧引起肝細胞死亡、凋亡和肝臟的炎病浸潤。IL拟6是肝臟KCs產生的另一種重要促炎因數，可與TNF拟α在協同促進肝內炎症的產生。相反IL拟10可通過抑制各種促炎因數的生成，從而減少肝內中性粒細胞的浸潤。大蒜素是從大蒜中提取出的一種有效成分，其作用十分廣泛。有文獻報導其對CCl4及乙醇所致的急、慢性肝損傷有明顯的保護作用〔5，6〕。在我們以往的研究中也發現，其對高脂飲食所致肝臟慢性損傷也有較好的保護作用。為進一步證實大蒜素是否可能通過調節KCs分泌功能來改善肝組織慢性損傷，實驗中以高脂飲食複製慢性肝損傷模型。檢測結果表明，模型組大鼠發生脂肪肝炎時，血漿促炎因數IL拟6、TNF拟α明顯升高而抑炎因數IL拟10顯著降低，大蒜素可抑制IL拟6水準的升高。體外實驗進一步證實，大蒜素可降低KCs對IL拟6、TNF拟α的表達，在提高IL拟10的表達方面作用十分顯著。說明大蒜素可通過調節KCs的分泌，改善肝臟內促炎因數與抑炎因數的失衡，參與對肝臟慢性損傷的保護作用。