探索藻類中藥中多糖對雙歧桿菌的促增殖作用
。方法：在恒溫條件下，以時間和多糖濃度為影響因素，瞭解不同藻類中多糖對雙歧桿菌的促增殖作用，對其量效關係進行分析結果：實驗結果表明在 37℃多糖濃度在0到2％範圍內，雙歧桿菌數隨多糖濃度的增加而上升；多糖濃度繼續升高，則反而下降。結論：海藻中多糖在一定濃度下能很好地促雙歧桿菌生長。一、前言
藻類是低等的海洋隱花類植物，包括紫菜、海帶、羊棲菜等。其含有多種生命物質，尤其是海藻多糖有調節細胞分裂與分化、調節細胞生長和衰老及維持生命有機體的正常代謝的功效活性。能夠起到抗病毒、抗腫瘤、抗輻射、抗突變、抗氧化、增強免疫機能的效果。隨著多糖研究的進展，藻類以其很好的藥用價值而得到廣泛和深入的研究。
雙歧桿菌做為人體腸道內占絕對優勢，對人體具有許多重要生理功能的有益菌。隨著微生態學的迅猛發展，雙歧桿菌的臨床保健作用逐漸被人們認識和接受，並對其進行了更深入的研究。
研究藥用海藻中多糖對雙歧桿菌的促增殖作用，驗證海藻中多糖對雙歧桿菌有顯著的增殖作用，可作為雙歧因數進一步開發研製，促進微生態學發展。而我們的日常膳食結構中盡可能多調配這類食物，以促進腸道內雙歧桿菌的生長，調節腸道菌群結構，使雙歧桿菌等有益菌群佔優勢。
雙歧桿菌是人體的生理細菌，為革蘭氏陽性細菌，無芽孢，不運動，嚴格厭氧，形態多變，不同種或同種不同菌齡，不同生長環境而呈現彎曲杆狀L或Y形等多種形態而得名，是人體腸道內數量最多餓一種菌。終生存在於人體與人的健康息息相關。
人的生理、免疫、營養、消化、抗腫瘤、抗衰老、藥物效能等都離不開人體自身攜帶的微生物群人體腸道內的雙歧桿菌具有有病治病，無病防病和保健的作用，它能形成生理屏障，阻止致病菌的定植和入侵，保護宿主免受致病菌侵害。能改善蛋白質代謝，提供多種B族維生素，能促進鈣鐵吸收。還能提高免疫力，增強抗腫瘤等多種作用。雙歧桿菌的不足意味著人體發生健康危機，需要及時補充。
隨著微生態理論體系的建立，使雙歧桿菌的臨床保健作用逐漸被人們認識和接受。現國內雙歧桿菌微生態調節劑所用菌的生產培養原料較貴，如能選擇合適劑量的海藻多糖直接調節人體腸道菌，增殖體內雙歧桿菌則能有較廣的發展前景。
本實驗中的海藻多糖為雙歧因數。能促進雙歧桿菌增殖所必需的無毒物質稱為雙歧因數，雙歧因數有的是含氮多糖或寡糖，有的是粘蛋白或酶類，有的是肽類或核酸成分其來源充足，分佈廣泛。
二、海藻多糖促雙歧桿菌生長實驗
（一）實驗材料
1．樣品
羊棲菜多糖：利用乙醇沉澱法從羊棲菜中提取。
海帶多糖：利用乙醇沉澱法從海帶中提取。
海藻 為馬尾藻科植物海蒿子或羊棲菜的藻體。鹹寒，歸肝腎經，有消痰軟堅，利水消腫之作用。《本草綱目》中記載：海藻，現鹹能潤下，寒能泄熱引水，故能消癭瘤，結核之堅聚，而除浮腫、腳氣、痰氣之濕熱，使邪氣自小便出也。
昆布 為海帶科植物海帶或翅藻科植物昆布的葉狀體。鹹寒，歸肝腎經，有消痰軟堅，利水消腫之作用。《別錄》記載昆布，主十二種水腫，癭瘤聚結氣。
本實驗中將用羊棲菜和海帶
羊棲菜[Sargassum fusiforme (Harv.) Setch]：藻體黃褐色，肥厚多汁，高15~ 40c m。固著器為是北太平洋西部特有的暖溫帶植物，屬褐藻類馬尾藻科。是一種營養豐富的藻類，幹品每百克含蛋白質 10.6克，糖類 47克，灰分 18.3克 ，脂肪 1.3克，鈣1400毫克，磷100毫克，鉀4400毫克，鐵5.5毫克，胡蘿蔔素550毫克；還有多種維生素和微量元素。
海帶[Laminaria japonica Aresch]屬褐藻門海帶科，是一種大型食用海藻，有豐富的營養。每 100克海帶中含有蛋白質 8克， 甘露醇 14克，鉀 4.36克、鐵150毫克，超過菠菜，油菜幾倍至幾十倍。更為突出的是，海帶富含微量元素碘，每 100克海帶含碘高達24000微克。
多糖提取工藝
取海藻置於託盤放入恒溫培養箱低溫烘乾，用電磨機打碎，使之成粉末狀。用天平稱取海藻粉 50g放入 500ml錐形瓶中加蒸餾水 250ml放置于 95℃水浴鍋中，並隔 10min晃一次，4h後取出，冷卻到室溫。離心取上清液，在離心管中加無水乙醇，得到沉澱再次離心，取沉澱(多糖)，用蒸餾水沖洗數遍，於37度烘箱中烘乾所得沉澱為粗多糖。
2．培養基：MRS肉湯培養基：
蛋白腖 10g、肉浸膏 10 g、酵母膏 5g、葡萄糖 20 g、吐溫80 1m l、K2HPO 42g、醋酸鈉 5g、檸檬酸銨 2g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·4H2O 0.05g、蒸餾水 1000ml。pH值6.4。
20％肉湯：蛋白腖 1g、肉浸膏 1g、蒸餾水1000ml。pH值6.4。
3．菌株：取自麗珠腸樂膠囊（由雙歧桿菌製成的乾粉膠囊），珠海麗珠醫藥集團股份有限公司，批號20030404。
4．實驗儀器
Nbox Jar 7.0L，法國生物梅裏埃公司
S.C.303型隔水式電熱恒溫培養與試劑
厭氧培養盒GE箱，嘉興新睦電器廠
除氧劑，法國生物梅裏埃公司
LD4－2高速離心機，北京醫用離心機廠
754型紫外可見分光光度計，上海第三分析儀器廠
TG328B電光分析天平
THZ－82型恒溫振盪器，江蘇太倉醫療器械廠
（二）實驗方法與結果
1．菌液與溶液製備
菌液製備：無菌條件下，從麗珠腸樂膠囊中取出內容物，溶解於 10ml濃度為0.9％的無菌生理鹽水，攪拌均勻後用接種針蘸取少許溶液，塗布於無菌MRS固體培養基平板上， 37℃下，于厭氧培養盒培養3d。再從平板中挑取色澤淡黃、圓滑突起的單菌落，接入 40ml MRS液體培養基， 37℃厭氧培養2d。取少量培養液，測得菌液濃度為2.7×108個/ml。使用前稀釋至1.0×108個/ml備用。 多糖溶液製備：利用蒽酮硫酸法測得醇沉澱中多糖含量：羊棲菜：25.2％；海帶：24.7％；將2種粗多糖分別配製成一定濃度的溶液，並按實驗需要稀釋為8.0％、4.0％、2.0％、1.0％、0.5％的水溶液，每管各 10ml，分別加入濃度為20％的肉湯培養基 10ml混勻，同時製備作為對照的10％肉湯， 115℃濕熱滅菌 15min後備用。
附. 蒽酮硫酸法測定多糖含量
原理：糖類遇濃硫酸脫水生成糠醛或其衍生物，可與蒽酮試劑縮合產生有色物質，反應後溶液呈藍綠色，於620nm處有最大吸收，顯色與多糖含量呈線性關係。
標準曲線的製作：分別取 0.1g/L的葡聚糖溶液0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.60， 0.80ml，用蒸餾水補到 1.00ml；分別加入 4.00ml蒽酮試劑，迅速浸入冰水浴中冷卻，各管加完一起進入沸水浴中，管口加蓋玻璃球，以防蒸發。自水浴重新煮沸起，準確煮沸10分鐘取出，用自來水冷卻，室溫放置10分鐘左右，於620nm比色。以同樣處理的重蒸餾水為空白，進行比色。以光密度(OD值)為縱坐標，糖的含量微克數為橫坐標，得標準曲線。
樣品含量測定：取相當於糖濃度50μg/ml左右的樣品溶液 1.00ml，加入蒽酮試劑，同標準曲線製作之操作，比色測定。根據標準曲線和樣品濃度計算含量。
標準曲線的製作
表為標準曲線相應資料
0 1 2 3 4 5 6 7
含糖量 ug 0 5 10 20 30 40 60 80
OD值 0.000 0.031 0.058 0.112 0.204 0.285 0.394 0.526
曲線Y=A BX 得：A= -4.89×10-3 B=6.71X10-3 r=0.998
依資料繪曲線
Y=0.00671-0.00489X；r=0.998
用分析天平取海帶多糖 0.1213g，溶於 100ml蒸餾水中，取 1ml進行吸光度測定。得吸光度：0.153，代入標準曲線得多糖29.9ug海帶提取物含多糖％＝0.0299×1000/121.3×100%=24.7%
用分析天平取羊棲菜多糖 0.2008g，溶於 100ml蒸餾水中，取 1ml進行吸光度測定。得吸光度：0.254，代入標準曲線得多糖50.6ug
羊棲菜提取物含多糖％＝0.0506×1000/200.8×100%=25.2％
三．促雙歧桿菌生長實驗
（一）時間因素
取3組濃度為2.0％、1.0％的多糖溶液管與作為對照的10％的肉湯液體管各 10ml,加入濃度為107個/ml的雙歧桿菌菌液各 0.1ml， 37℃厭氧培養。12h、24h、48h後，分別取樣用無菌生理鹽水稀釋，接種於MRS瓊脂平板上， 37℃厭氧培養4d，計算出每ml培養液中所含的活菌數。結果見表1。以雙歧桿菌活菌數對數為縱坐標，時間為橫坐標，繪得圖1。
三、分析與討論
從表2可以看到，在試驗濃度下，各類海藻多糖對雙歧桿菌均有顯著的促生長作用。加入不同濃度多糖的各試管雙歧桿菌活菌數明顯高於對照組（P<0.05）。圖2顯示，多糖在0.5％∼2.0％的範圍內，隨著濃度的增加，雙歧桿菌的活菌數呈上升趨勢，增長較為平緩，當濃度為2.0％的時候到達頂峰。說明在這一範圍內，羊棲菜多糖對雙歧桿菌的促生長作用與濃度呈正相關。然而在多糖濃度為4.0％的時候，雙歧桿菌活菌數出現下降。推測其原因，隨著多糖濃度的增高，培養液滲透壓也逐漸增大，使環境變得不利於雙歧桿菌生長，從而造成菌數減少。因此，本實驗結果顯示適合雙歧桿菌生長的羊棲菜多糖濃度在2.0％∼4.0％之間。在不同的海藻多糖之間，雙歧桿菌的活菌數也存在著差異，海帶多糖的促生長作用較強，而羊棲菜促生長則相對較弱，與前者相差一倍。在2.0％多糖濃度下 37℃培養24h，各類海藻多糖的促生長作用最強，海帶多糖培養液可以使雙歧桿菌的活菌數達到原來的6倍。
實驗結果表明海藻多糖是非常優良的雙歧桿菌促生長因數，能有效增加腸道內的雙歧桿菌數量。在服用海藻多糖時應控制好多糖的用量或者採用緩釋技術，使得多糖在一個合適的濃度到達腸道，並保持一定的時間，對雙歧桿菌的生長起到促進作用，促進雙歧桿菌在腸道內的增殖和定植，優化腸道的結構，維護機體的生態平衡，達到最佳的保健功效。根據表1，雙歧桿菌在厭氧條件下 37℃培養24h，活菌數達到高峰，此時是獲得雙歧桿菌最高生物量的最佳時間，為雙歧桿菌為主的微生態活菌製劑生產提供了有用的條件參數。
本實驗採用了10％肉湯培養基為基質，使各種營養成分降低到僅能維持備試菌生長的濃度，目的是減少營養成分的影響，更能準確反應添加各類多糖的促進效果。目前增殖腸道內雙歧桿菌有兩種方法，一是通過攝取含雙歧桿菌的食物，補充雙歧桿菌的不足。二是服用促雙歧桿菌生長的雙歧因數，直接扶持、促進腸道中原雙歧桿菌的生長、繁殖，優化腸道菌群結構，起調節腸道菌群的作用。但前者由於在儲存過程中活菌數不穩定而影響了治療效果。本研究證實，海藻多糖是一種新的天然雙歧因數，它對雙歧桿菌促生長實驗為海藻類中藥的營養保健價值提供了科學的實驗依據，也提示我們正確利用野生植物資源。如把海藻這類資源豐富的野生植物改造成營養保健食品，前景是非常廣闊的。
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