丹參根部提取的丹參酮ⅡA對SGC7901人胃腺癌細胞增殖凋亡的影響
探討其可能的作用機制。方法 體外常規培養SGC拟7901人胃腺癌細胞用於實驗，經TanⅡA作用後，採用MTT比色法檢測細胞增殖情況，電鏡及流式細胞儀觀察胃腺癌細胞凋亡及細胞週期分佈。結果 TanⅡA對胃腺癌細胞的生長有明顯的抑制作用，呈劑量依賴性，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)；TanⅡA作用後胃腺癌細胞表現為凋亡特徵性的形態改變；TanⅡA可時間依賴性地誘導腫瘤細胞凋亡。結論 TanⅡA對體外培養的SGC拟7901人胃腺癌細胞的生長有明顯的抑制作用和誘導凋亡的作用，其可能的機制為TanⅡA可將細胞阻滯於G0/G1期，使其不能進入S期。胃癌(carcinoma of stomach)是人類最常見的惡性腫瘤，占全部惡性腫瘤的10.5%，嚴重危害著人們的健康和生命。因此，對該病的防治倍受關注。自1972年Kerr等首次提出細胞凋亡概念以來，學者們研究發現腫瘤的發生與細胞的過度增殖及細胞凋亡通路受到抑制有關[1]。因此，誘導腫瘤細胞凋亡已成為抗癌藥物篩選的新靶點。研究發現，許多中藥單體、複方或從中提取的有效成分都是通過誘導腫瘤細胞凋亡來發揮抗癌抑癌功效的。丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA, TanⅡA)是從活血化淤中藥丹參根部提取的脂溶性有效成分，為一種櫻紅色針狀結晶，含有醌型結構，易被氧化還原，可參與機體的多種生化反應而有多種生物活性。因此，具有抗菌[2]、降低血液黏稠度、擴張冠狀動脈、抗血小板、清除氧自由基、抗脂質氧化及改善記憶力障礙等廣泛的藥理作用。近年來，TanⅡA的抗腫瘤活性也被陸續報導，但作用機制仍有待深入研究。在本研究中，我們擬採用不同濃度的TanⅡA體外干預SGC拟7901胃腺癌細胞，觀察其對胃腺癌細胞增殖、凋亡的影響，為胃癌的臨床治療探索新的途徑。 1 材料與方法
1.1 材料 TanⅡA購自中國藥物製品檢定所，為化學標準品，溶於 二甲亞碸(DMSO)中 4℃冷藏備用。RPMI拟1640培養液購自GIBCO公司；人胃腺癌細胞株(SGC拟7901)由西安交通大學醫學院第一附屬醫院臨床分子實驗中心提供， 37℃恒溫，50%(體積分數)CO2密閉傳代培養。
1.2 方法 TanⅡA溶解於DMSO。DMSO終濃度為0.02%(體積分數)。用細胞培養液將TanⅡA配製成0、0.5、1.0、2.0、5.0、 10.0mg/L不同品質濃度的工作液，設 0mg/L濃度為對照組。實驗將根據MTT結果選取最佳作用濃度的TanIIA處理癌細胞。
1.2.1 MTT比色法檢測SGC拟7901細胞的增殖 將SGC拟7901細胞用胰蛋白酶消化後，血細胞計數盤計數，用含10%(體積分數)小牛血清的1640培養液製備為2×105個/mL細胞懸液，接種于96孔細胞培養板內，每孔200μL，生長24h後，隨即將其分為6個作用組，每組6複孔。分別加入終濃品質度為0、0.5、1.0、2.0、5.0、 10.0mg/L的TanⅡA培養液,分別於作用24、48、72h後每孔加入新鮮配置的 5g/L MTT儲存液20μL，繼續孵育4h後，棄去上清液，每孔再加入150μL DMSO溶解細胞內結晶，5 -10m in後，490nm酶標測定儀測定吸光度(A)值。抑制率=(對照孔A490-實驗孔A490)/對照孔A490×100%。
1.2.2 透射電鏡觀察 收集處於對數生長期的SGC拟7901人胃腺癌細胞，接種于 25mL培養瓶內，隨機分為兩組，分別加入0、 10.0mg/L TanⅡA，每組各6瓶細胞。藥物處理細胞72h後，用胰蛋白酶消化細胞，置於EP管中，2000r/min，離心 10min，棄去上清，收集細胞。加入 4℃預冷前固定液 20g/L戊二醛固定2h，PBS液清洗， 10g/L鋨酸固定1-2h，梯度脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡下觀察並攝影。
1.2.3 流式細胞術檢測細胞週期 取培養于 25mL培養瓶中的生長良好的SGC拟7901細胞，分別加入不同濃度TanⅡA干預，使終濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、 10.0mg/L，設 0mg/L濃度為對照組。待藥物作用72h後收集細胞，在PI、Annexin V雙染色法下行流式細胞儀檢測凋亡率及 10.0mg/L TanⅡA干預後細胞週期的分佈。
1.3 統計學處理 所有實驗資料登錄電腦中，採用SPSS11.0 for windows套裝軟體進行統計分析。實驗結果計量資料均以均值±標準差(±s)表示；MTT 法中每份標本平行測定6孔，求其(±s)，進行方差分析、SNK拟q檢驗；流式細胞術所測得的細胞週期構成以中位數M表示，進行構成比的χ2檢驗。檢驗水準為0.05。
2 結果 2.1 SGC拟7901細胞的增殖情況 不同濃度的TanⅡA作用細胞後，細胞生長受到不同程度的抑制，這一抑制作用隨TanⅡA濃度的變化而變化，顯微鏡下觀察可見細胞形態發生了明顯變化(圖1、2)；組間 兩兩比較均有顯著性差異(P<0.01)，並且濃度與抑制率間呈現明顯的依賴效應(表1)。 2.2 透射電鏡下細胞形態的變化 對照組的胃腺癌細胞胞核較大，有凹陷，畸形核或分葉核，染色質均勻。給予 10.0mg/L TanⅡA後，細胞體積縮小，表面出現粗大的突起，細胞器腫脹，核固縮，染色質邊集於核膜下，形成新月形小體，核膜消失或突起，核質濃縮，發生碎裂，形成凋亡小體，呈早中期的凋亡表現的細胞數明顯增多。在凋亡晚期，可見膜包裹的內含細胞器和細胞核碎片的凋亡小體。
2.3 細胞週期和細胞凋亡的情況 10.0m g/L TanⅡA干預後，對照組SGC拟7901細胞週期分佈分別為G1期49.8%、S期42.7%、G2期7.5%；TanⅡA組SGC拟7901細胞週期分佈分別為G1期59.1%、S期32.2%、G2期8.7%，TanⅡA組較對照組G1/G2期細胞數量增多，而S期細胞數量減少(圖3)。FCM定量顯示， 10.0mg/L TanⅡA作用後0、24、48、72h的凋亡率分別為0.2%、9.87%、26.39%、55.36%，隨時間的延長，凋亡細胞增多，72h的凋亡率達到最高值，隨後逐漸下降，與對照組比較，48、72h處理組凋亡率增高有統計學意義(P<0.01，圖4)。
3 討論 人們已知腫瘤的發生不僅與細胞過度增殖、分化受阻這些因素有關，還與細胞凋亡通路受到抑制、細胞壽命延長有關。因此，誘導腫瘤細胞凋亡已成為抗癌藥物篩選的新靶點。通過誘導劑使腫瘤細胞凋亡增加、增殖力減弱達到治療的目的[3]。由於中藥治療腫瘤的毒副作用小，使得其在腫瘤治療方面顯示出越來越大的優勢，在我國也形成了中藥治療腫瘤的一大特色。
袁淑蘭等[4]在以往對TanⅡA抗腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞分化的研究基礎上，進一步探討了TanⅡA對HL拟60細胞誘導凋亡的作用及可能的機理。結果表明 2mg/L TanⅡA作用HL拟60細胞5d即可誘導凋亡的發生，細胞出現典型的凋亡形態改變，DNA瓊脂糖凝膠電泳出現明顯的DNA梯狀降解；隨藥物濃度增加，凋亡細胞數目也隨之增加，DNA梯狀降解也愈加明顯。而在以往的實驗中發現採用無毒劑量的TanⅡA( 0.5m g/L)作用HL拟60細胞，在誘導腫瘤細胞分化成熟的同時伴有細胞凋亡的發生。故推測小劑量TanⅡA可誘導腫瘤細胞向良性分化，同時誘導凋亡或誘導分化最終走向凋亡；而高濃度TanⅡA對腫瘤細胞則具有誘導凋亡作用，這也是TanⅡA發揮抗腫瘤作用的機理之一。本研究發現，TanⅡA對體外培養的SGC拟7901人胃腺癌細胞的生長有明顯的抑制作用，細胞出現凋亡的典型形態改變。細胞週期是腫瘤研究的熱點，腫瘤的過度增殖與細胞週期調控因數紊亂有關[5拟6]。正常細胞具有一系列調節系統來感受細胞週期的進行。當細胞受到損害時，會在相應的階段終止細胞週期。若損害能修復則重新進入細胞週期，若損害難以修復則進入不可逆的G0期或自主凋亡。這些監管細胞週期運行、負責當損害發生時使其停滯的分子調節機制稱為細胞週期的關卡。有實驗將丹參酮作用於人肝癌SMMC拟7721細胞觀察到細胞生長明顯受抑制，細胞被阻止於G0/G1期，S期細胞數量明顯減少。在細胞週期中，G1末期向S期是否順利過渡，意味著細胞是否由G1期進入S期，此時細胞內相關基因表達水準及時而有顯著的變化，為下階段DNA複製做好了準備。因此，這一轉變對於推進癌細胞週期進程具有重要意義[7]。本研究通過FCM測定細胞週期顯示， 10mg/L TanⅡA干預後的SGC拟7901細胞週期較對照組G1/G2期細胞數量增多，而S期細胞數量減少，表示TanⅡA可將細胞阻滯於G0/G1期，使其不能進入S期，從而抑制DNA合成和細胞增殖。G1期阻滯可使細胞增殖週期延長，增殖減慢。綜上所述，TanⅡA對SGC拟7901人胃腺癌細胞的生長有明顯抑制作用和凋亡誘導作用。這為TanⅡA作為抗腫瘤藥物用於臨床治療提供了一定的實驗依據。
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